解決方案人表皮生長因子受體2（HER2）是酪氨酸激酶的跨膜受體，是表皮生長因子受體（EGFR）家族的一員，具有酪氨酸激酶活性，在組織發育中起至關重要的作用，是胚胎髮育所必需的。在正常成年人機體組織中，HER2通常低表達或不表達。但是，HER2的過表達往往會引起正常生物學功能的紊亂。許多研究表明，HER2的表達與多種腫瘤的發生、發展密切相關，如乳腺癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌等。因此以HER2為靶點的腫瘤靶向治療一直是研究的熱點。
2022年7月一篇發表在Researchgate網站上的名為「Designing a Humanized Immunotoxin Based on HER2 Specific scFv and DFF40 Toxin Against Breast Cancer: An In-Silico Study」的文章，提出以分子模擬技術來進行基於HER2特異性scFv和DFF40毒素設計抗乳腺癌人源化免疫毒素的研究。
曲妥珠單抗是一種能與HER2受體結合的抗體，其衍生的單鏈抗體(scFv)可用於設計靶向HER2陽性癌細胞的免疫毒素。DFF40是一種由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活的核酸酶，負責細胞凋亡過程中的基因組DNA片段化。在該研究中，研究人員利用生物信息學工具設計了含有HER2特異性scFv和DFF40毒素的免疫毒素。將scFv和DFF40的氨基酸序列通過肽鏈連接，構建免疫毒素。然後對該結構的二級結構、理化特性、溶解度和致敏性進行了預測，並進行三維結構的建立、改進和評估，最後分別進行蛋白-蛋白對接和分子動力學研究，評價免疫毒素與受體的結合和免疫毒素的穩定性。結果表明，所設計的蛋白是一種溶解度適宜的穩定蛋白，不具有過敏原性質，具有與HER2結合的合適結構。最後，該構建體有望成為製備靶向HER2免疫毒素的候選材料。然而，需要進行不同的體外和體內免疫學試驗來確認所設計的結構的效果。
實驗方法
1
結構設計
將曲妥珠單抗(赫賽汀)單鏈抗體(scFv)與DFF40毒素偶聯，構建融合蛋白曲妥珠單抗-DFF40。從UniProtKB (http://www.uniprot.org/)中獲得融合蛋白的氨基酸序列。(G4S)3是一種柔性肽連接體，用於將赫賽汀的VL和VH與DFF40結合(圖1)。
2
二級結構評價
首先根據一級氨基酸序列對曲妥珠單抗-DFF40融合蛋白的二級結構進行預測。首先分別分析VL和VH的二級結構，然後評估scFv及其連接子的結構。
3
物理化學性質和溶解性分析
蛋白質的物理化學性質對其穩定性和溶解度有實質性的影響。因此，作者首先計算研究了曲妥珠單抗-DFF40融合蛋白的理論等電點(pI)、分子量(MW)、總電荷、不穩定指數、脂肪指數和總平均親水性等理化特性。使用AI預測結構的溶解度。
4
構建三維模型，改進和驗證建模結構
首先通過建模構建曲妥珠單抗-DFF40融合蛋白的三維結構並進行優化，優化方法包括側鏈重建和修復。最後評價三維結構的質量。
5
抗原性預測
通過基於非序列描述符的指紋識別方法評估該蛋白的過敏原性。
6
mRNA 穩定性預測
根據能量最小化預測設計的免疫毒素的單鏈RNA或DNA序列的二級結構。
7
蛋白-蛋白對接分析
利用蛋白蛋白對接軟件預測從PDB數據庫獲得的HER2 (PDB ID: 5WJL)受體與設計的免疫毒素之間的受體-配體相互作用模式。
8
分子動力學模擬研究
通過MD模擬研究，選擇相互作用最強的HER2免疫毒素模型評估其穩定性和結構變化。分子動力學的模擬使用GROMACS 2018包和OPLS-AA力場在一個10Å立方的模擬盒中進行，採用SPC作為水模型。然後，系統的電荷被Na+和Cl-離子中和。採用最陡下降法最小化對接模型的能量，通過5000步最小化，Fmax小於100 kJ/mol/nm。此外，對模擬系統進行了100ps NVT(粒子數、體積和溫度恆定)和NPT(粒子數、壓力和溫度恆定)的平衡。使用線性約束求解器(LINCS)算法對所有約束進行組織。採用半徑為1.0 nm、網格間距為0.16 nm的PME算法計算靜電相互作用。最後，對於HER2 -免疫毒素複合物，在平衡系統上用兩個fs時間步長進行了100 ns的模擬過程。評價HER2 -免疫毒素複合物的穩定性、計算溶劑可及表面積(SASA)、均方根偏差(RMSD)、氫鍵(H-bonds)、均方根波動(RMSF)和旋轉半徑(Rg)。
實驗結果
1
融合蛋白的構建
從PDB和Uniprot數據庫中檢索曲妥珠單抗scFv和DFF40蛋白的氨基酸序列。選擇GGGGSGGGGSGGGGS氨基酸序列作為VL和VH之間的連接物，用於形成赫賽汀。該柔性連接子也被選為連接抗體與毒素的最佳連接子。
2
二級結構預測
預測scFv和曲妥珠單抗 (scFv-DFF40蛋白)的二級結構。結果表明，在scFv中加入DFF40並形成嵌合蛋白，並不改變該片段的二級結構。二級結構由20.37%的α-螺旋、22.39%的延伸鏈和57.24%的無規捲曲構成。
圖2：設計的免疫毒素的二級結構。c:無規螺旋，e:延伸股，h: α螺旋
3
理化性質和溶解度評價
對嵌合蛋白序列進行理化性質分析。根據所得結果，分子量為65.95 kDa，理論pI為9.12，淨電荷為+16。結果表明，嵌合蛋白是可溶的，概率評分為0.57。
4
建立三維模型，對模型進行修正和驗證
在本研究中，基於氨基酸序列預測蛋白質的三維結構；為該免疫毒素創建了5個3D模型。根據三維建模模型計算的置信值(c-score)，在5個模型中，選擇c-score為0.32的模型1(圖3)為置信值最高的模型。為了進一步完善預測模型，研究人員選擇了Ramachandran圖中最有利區域作為進一步研究的模型。研究人員對嵌合蛋白結構進行驗證，並對所選模型改良前後的質量進行評價。未細化和細化模型在拉氏圖中殘基分佈的比較見表1。改良後，最優區氨基酸比例由50.7%提高到66.9%。改進後的模型Z-score為-7.02，為可接受值(圖4)。
圖3免疫毒素的三維結構。scFv: 1 ~ 256個氨基酸；DFF40: 257 – 594
表1：改良前後拉氏圖中模型的氨基酸位置
圖4：改進模型的Z-score -7.02。z-評分顯示了與實驗定義結構相比的總體模型質量
5
過敏性評價
評估嵌合蛋白致敏潛能的結果，設計的嵌合蛋白是一種非致敏原。
6
mRNA穩定性評價
通過最小自由能(MEF)預測mRNA二級結構。結果顯示，由於熱力學集合的負自由能(−825.79 kcal/mol)，該mRNA是穩定的。
圖5：預測的mRNA二級結構
7
蛋白-蛋白分子對接
利用蛋白蛋白對接軟件進行免疫毒素與HER2受體的分子對接。根據 (Kd)評分最低(5.7E-16)、HER2受體與所設計免疫毒素之間氫鍵和疏水鍵數量最多，選擇最佳複合物。此外，加權評分和結合親和力(ΔG)分別為-1025.9和-20.8 (Kcal/mol)。結果表明設計的免疫毒素與HER2受體之間存在較強的相互作用 (圖6)。
圖6：HER2-免疫毒素複合物的分子對接為紅色，設計的免疫毒素為藍色。在特寫圖中，顯示了與設計的免疫毒素相互作用的HER2結合位點中的殘基。b HER2和設計的免疫毒素之間疏水和氫相互作用的LIGPLOT表示。HER2(綠色)和免疫毒素(綠色)殘基之間的氫鍵用藍色虛線表示，疏水作用用代表HER2殘基(黑色)和免疫毒素殘基(藍色)的輪輻弧表示。
8
分子動力學研究
計算機模擬為理解粘附的基本物理和力學提供了一種強大的技術。蛋白質-蛋白質相互作用在大多數細胞過程和生物學功能中起着關鍵作用。MD模擬是一種簡單而快速的評估蛋白-蛋白相互作用和複合物穩定性的方法。
通過MD模擬實驗評價HER2 -免疫毒素複合物的穩定性。通過基於骨架結構的RMSD評估100 ns過程中的結構變化。結果表明，在100 ns模擬過程中，HER2 -免疫毒素複合物的RMSD值穩定（圖7）。HER2 -免疫毒素複合物的平均RMSD值為1.2 nm。該複合物骨架原子的RMSD表明，經過約40 ns的模擬後，複合物達到穩定狀態，並一直保持到100 ns。通過Rg值評估蛋白-蛋白複合物的摺疊和緻密性，HER2-免疫毒素複合物的Rg值範圍為3.4 ~ 3.8 nm，模擬50 ~ 100 ns時間的Rg值範圍為3.7 ~ 3.8。這些結果表明，在100 ns模擬過程中，HER2-免疫毒素複合物中蛋白質的壓縮發生了最小的變化(圖8)。RMSF值反映了蛋白質在模擬時間內的靈活性和結構變化。設計的免疫毒素和HER2蛋白的RMSF圖表明，隨着模擬時間的推移，每個殘基的靈活性和互動性最小。對這一結果的分析表明，免疫毒素與HER2受體對接後是穩定的。
蛋白質複合物中的氫鍵在其穩定性中起重要作用。如圖5所示，在MD模擬過程中，氫鍵數量是穩定的。SASA值評估分子與溶劑的結合水平，對HER2-免疫毒素複合物的SASA圖分析顯示，在MD模擬過程中，分子與溶劑的結合表面積穩定。
圖7：MD模擬分析HER2 -免疫毒素複合物在100 ns時期的變化。a RMSD圖，b Rg圖，c H-bonds圖，d SASA圖
圖8：MD模擬分析100 ns時期HER2-免疫毒素複合物，a為設計免疫毒素的RMSF圖，b為HER2受體的RMSF圖
結論：
在本研究中，作者通過計算機模擬設計一種有效的抗HER2陽性乳腺癌的免疫毒素，該毒素對赫賽汀耐藥。採用不同的生物信息學工具和服務器對免疫毒素的構象和結構進行評價。此外，通過對接和MD研究分析其與HER2受體的結合親和力。結果表明，所設計的免疫毒素構象正確，結構穩定。結合實驗結果表明，該免疫毒素能與HER2受體有效結合。
